研究背景
炎症病变中巨噬细胞水平的增加是类风湿性关节炎的一个关键特征，它浸润滑膜组织并导致关节糜烂。巨噬细胞具有可塑性和多能性，可以在不同的微环境下分化为促炎性巨噬细胞(称为M1)和抗炎性巨噬细胞(称为M2)。自身免疫性疾病和过度炎症反应使巨噬细胞的极化永久化为促炎表型(M1)，从而导致类风湿性关节炎。新出现的证据表明，环状核糖核酸富含微小核糖核酸的结合位点，可以通过复杂生物过程中的竞争性内源性核糖核酸(ceRNA)机制吸收微小核糖核酸，如自身免疫失衡、炎症反应和致癌作用。在类风湿关节炎中发现了许多特异性表达的环核糖核酸，其中一些通过ceRNA机制调节类风湿关节炎。然而，环核糖核酸/微小核糖核酸ceRNA网络在类风湿性关节炎中的确切机制尚未完全了解。作者已经通过RNA测序确定了类风湿关节炎患者中环核糖核酸的特异性分布。circRNA_是RA中表达最异常的circRNA之一，也可以通过生物信息学分析预测的ceRNA机制与miRNA相互作用。此研究旨在利用巨噬细胞模型和胶原诱导性关节炎(CIA)小鼠模型，探讨circRNA_在体内外的功能和分子机制。
研究结果
1.对RA中差异表达的circRNA进行筛选
通过对三名患者和三名对照组的外周血单个核细胞进行核糖核酸测序，筛选出差异表达的环状核糖核酸。如图1a-c所示，类风湿性关节炎中有20个上调和41个下调的异常表达环核糖核酸。通过对三名患者和三名对照组的外周血单个核细胞进行RNA测序，筛选出差异表达的circRNA。如图1a-c所示，类风湿性关节炎中有20个上调和41个下调的异常表达环核糖核酸。表1分别列出了在类风湿关节炎中差异表达的前十个最显著上调和下调的环状核糖核酸。前20个失调的环状核糖核酸通过核糖核酸序列进行筛选，并通过实时聚合酶链反应在来自36名患者和30名对照的PBMC样本中进行验证。类似于RNA测序的结果，9个环状RNA显著上调，而8个环状RNA在RA外周血单个核细胞中显著下调(图1d，e)。其中，在类风湿关节炎患者外周血单个核细胞中,circRNA_表达上调最显著。最有趣的是，circRNA_的表达与类风湿关节炎患者血清中的ESR、CRP和RF呈正相关(图1f–h)，表明circRNA_的表达与类风湿关节炎疾病活动之间存在显著关系。最重要的是，与对照组相比，还发现类风湿关节炎患者外周血单核细胞中circRNA_的表达显著增加(图1i)。
2.CircRNA_促进巨噬细胞增殖和细胞周期进程
与LV-NC组(图2a)相比，当细胞被circRNA_过表达的慢病毒质粒转染时，巨噬细胞中circRNA_的表达显著增加。相反，与sh-NC组相比，sh-circRNA质粒转染的巨噬细胞中circRNA_的表达降低(图2b)。如荧光原位杂交(FISH)所示，circRNA_主要位于巨噬细胞的细胞质中(图2c)。作者在体外研究了circRNA_对巨噬细胞生长的影响。正如EdU和CCK-8所证明的，当circRNA_过表达时，巨噬细胞的增殖显著增加，但当circRNA_在巨噬细胞中被敲除时，巨噬细胞的增殖减少(图2d-g)。此外，流式细胞仪显示circRNA_也能促进巨噬细胞的细胞周期进程(图2h，I)。综上所述，circRNA_能够在体外促进巨噬细胞增殖和细胞周期进程。
3.CircRNA_通过CIRCRNA_–MiR-ceRNA网络调节巨噬细胞炎症反应
在类风湿关节炎患者的微视野中也发现了miR-的表达(图3a)。在过度表达circRNA_的巨噬细胞中观察到circRNA_和miR-之间的负相关(图3b)。此外，通过生物信息学分析，预测miR-是circRNA_的靶向miRNA。MiR-能够特异性识别circRNA_序列的13个碱基(图3c)。图3d显示了潜在的circRNA_–MiR_–基因网络，该网络在Miranda和TargetScan数据库中进行了扫描。鉴于这些发现，我们假设circRNA_可以通过ceRNA机制通过吞噬miR-来调节巨噬细胞。此外，荧光素酶报告分析支持了这一假设(图3e)。此外，RIP分析显示，在抗Ago2组的免疫沉淀物中，circRNA_和miR-均升高(图3f，g)。与IgG组相比，在miR-抑制剂处理组中，circRNA_和miR-抑制剂均减少(图3f，g)。因此，circRNA_在巨噬细胞中可以作为miR-海绵发挥作用。在接下来的实验中，我们研究了巨噬细胞介导的炎症在类风湿关节炎发病中的作用。CircRNA_促进巨噬细胞中肿瘤坏死因子-α、白细胞介素-6和白细胞介素-12mRNAs的表达(图3h-j)。巨噬细胞培养上清液中这些细胞因子的蛋白水平在细胞中过度表达circRNA_时也增加了(图3k–m)。然而，使用miRNA模拟物的拯救试验表明miR-模拟物可以抑制circRNA_对巨噬细胞炎症的影响(图3k–m)。综上所述，circRNA_通过ceRNA机制在体外通过miR-海绵调节巨噬细胞炎症反应。
4.CircRNA_–MiR-CERna靶向调节依赖巨噬细胞中IκBα/NF-κB信号通路的AKT1
图4a显示AKT1是miR-的潜在靶基因，因为它在miR识别的3′-非翻译区(UTR)有互补碱基。在巨噬细胞中发现AKT1和miR-之间的负相关(图4b，c)。此外，荧光素酶报告分析支持miR-可以下调AKT1的表达，而miR-抑制剂可以抑制其作用(图4d)。总之，AKT1是miR-的靶基因。而且，circRNA_可以促进巨噬细胞中AKT1、p-IκBα和p-NF-κB的表达(图4e)。然而，miR-模拟物可以通过circRNA_/miR-海绵部分挽救这种效应(图4e)。这些发现表明，circRNA_可以通过充当miR-海绵来充当ceRNA，并通过巨噬细胞中的AKT1/NF-κB信号通路调节炎症反应。
5.阻断巨噬细胞中的circRNA_可减轻炎症和关节损伤
按照图5a中的流程图构建CIA小鼠模型。与对照组小鼠相比，阻断巨噬细胞中的circRNA_显著降低了平均关节炎评分并延长了首次出现关节炎的时间(图5b)。在sh-CIRCRNATE转染的巨噬细胞处理的小鼠中观察到不太严重的关节损伤、软骨下骨侵蚀减少和组织中的淋巴细胞浸润(图5c，d)。在巨噬细胞中敲除环核糖核酸_保护CIA小鼠免受严重的骨破坏，如在组织形态测定中所见(图5e，f)。CIA小鼠的滑膜炎和软骨损伤在用circRNA_阻断的巨噬细胞治疗时明显减轻(图5g)。在给予sh-circRNA质粒转染的巨噬细胞的CIA小鼠的外周血单核细胞和滑膜中，circRNA_减少(图6a，b)。F4/80+巨噬细胞在小鼠滑膜组织中较少浸润(补充图2)。阻断巨噬细胞中circRNA_后，小鼠外周血单个核细胞中IL-6和TNF-αmRNA的表达显著降低(图6c，d)。
小鼠血清中IL-6和TNF-α的细胞因子在用circRNA_敲除的巨噬细胞处理的小鼠中也明显减少(图6e，f)。此外，用免疫组织化学方法检测小鼠滑膜组织中p-AKT1和p-NF-κB的表达。在用circRNA_阻断巨噬细胞处理的CIA小鼠中，关节滑膜组织巨噬细胞中AKT1和NF-κB的磷酸化和活化被显著抑制(图6g，h)。因此，可以认为circRNA_可以影响体内CIA小鼠的炎症反应。阻断巨噬细胞中的circRNA_可减轻CIA小鼠的炎症和关节损伤。
讨论
circRNA_通过充当miR-的ceRNA通过AKT1/NF-κB信号通路来调节巨噬细胞炎症。阻断巨噬细胞中的circRNA_可以减轻CIA小鼠的炎症和关节损伤。这些发现显示了强有力的证据支持使用circRNA_作为类风湿关节炎免疫治疗的靶点。然而，需要更多的机制和功能相关的实验来探索其作为未来类风湿关节炎的有效治疗策略。
查看原文
转载请注明地址:
http://www.exmdc.com/zcmbwh/109319.html
当前时间：